Herbicidai veikia cheminėmis medžiagomis trukdydami piktžolių fiziologiniams ir biocheminiams procesams, dėl kurių jos žūva arba sulėtėja augimas. Herbicidų veikimo mechanizmai yra įvairūs, daugiausia apima šiuos:
1. Fotosintezės trukdžiai: Pavyzdžiui, triazino herbicidai blokuoja fotosintezės elektronų pernešimo grandinę, todėl piktžolės miršta, nes negali sintetinti energijos;
2. Aminorūgščių sintezės slopinimas: Pavyzdžiui, glifosatas slopina EPSP sintazę, blokuodamas aromatinių aminorūgščių sintezę;
3. Ląstelių dalijimosi sutrikimas: Pavyzdžiui, dinitroanilino herbicidai slopina mikrotubulių susidarymą, užkerta kelią ląstelių dalijimuisi;
4. Augalų hormonų imitavimas: pavyzdžiui, 2,4{4}}D per daug stimuliuoja augimą, todėl piktžolės deformuojasi ir miršta. Herbicidų selektyvumas priklauso nuo medžiagų apykaitos skirtumų tarp pasėlių ir piktžolių; neselektyvūs herbicidai naikina visus augalus.
